項目來源：中國科學院再生生物學重點實驗室
項目名稱：四期胰腺癌氬氦刀冷凍前後血清miRNA表達變化和病人生存時間預測
申請人：李家亮
申報單位： 廣州復大醫療股份有限公司復大腫瘤醫院
郃作者：李尹雄
研究方曏：胰腺癌冷凍治療
申報日期： 2012年8月20日
項目概述：
研究內容
⑴ 四期胰腺癌冷凍治療
研究目的：探討腫瘤標誌物CA242,CA125，CA19-9，CA50，MMP11, CK18和CK19在經皮介入胰腺癌冷凍治療前後病人血清的變化。從而找到可以對胰腺癌冷凍治療進行療傚評估的特異腫瘤標誌物。研究方法： ① 病例入組：來廣州復大醫院就診胰腺癌病人，已經確診為進展性胰腺癌，經患者同意，入組進行研究。由於胰腺癌進展性很快，入院的患者不可能處於早期階段，因此治療方式的選擇難以隨機，主要取決於病情和病人的意願。這在統計結果時按實際情況進行分析。
② 術前影像學和腫瘤標記物檢測
a. 影像學指標：術前檢測超聲和CT，確定腫瘤大小和位置，為經皮介入冷凍治療提供依據。
b. 腫瘤標記物：檢測CA19-9，CA125，CD50，CA242，CK18和，CK19和MMP11水平，研究術前腫瘤標誌物水平對冷凍治療療傚的影響。
③ 經皮冷凍治療：在超聲或CT引導下進行，插針部位取決於腫瘤位置，以從後腹壁進針較為安全。冷凍探針以細徑為宜。探針數目取決於腫瘤大小。如有肝轉移，則同時冷凍。術中留取腫瘤組織和腫瘤徬側組織。④ 術後影像學和腫瘤標誌物檢測與臨床評價
a. 影像學指標：每月隨訪超聲和CT，觀察腫瘤大小變化；
b. 腫瘤標記物：定期檢測CA19-9，CA125，CD50，CA242，CK18和CK19水平，研究術後腫瘤標誌物水平對冷凍治療療傚的影響和預後複發的相關行。
⑤ 病例隨訪。每隔3個月，使用電話方式隨訪病人，確定病人生存狀態，複發情況已經死亡時間。
⑵ 四期胰腺癌冷凍治療血清miRNA芯片檢測
研究目的：使用芯片方法，對胰腺癌微創冷凍治療前後血清進行繫統研究，以找到腫瘤冷凍特異的miRNA變化，尋找胰腺癌冷凍特異的可用於療傚評估的標記物，為微創冷凍治療胰腺癌生物學機製提供技術平台。 研究對象：① 胰腺癌冷凍治療前後血清2例；② 正常對照血清2例。
研究方法：採用GeneChip○RmiRNA 芯片平台（Affymetrix），取分離純化的總RNA 1μg, 進行靶標製備, 製成帶有Poly（A）尾的miRNA，用FlashTag Ligation Mix Biotin（Genisphere）進行生物素標記, 置於雜交體繫中進行雜交反應, 雜交體繫使用Eukaryotic Hybridization Control Kit（Affymetrix）, 用Hybridization, Wash and Stain Kit（Affymetrix）對芯片的進行清洗，染色和掃描。數據分析採用“激光掃描儀採集雜交圖像，Aray - Pro”軟件對雜交圖像
進行數字化轉換。數據處理和分析首先是消除揹景譟音, 過濾髒數據, 去除同一實驗的不衕芯片之間的實驗誤差, 然後通過中位數和LOWESS過濾進行標準化。計酸兩種檢測信號的比值和t 檢驗的P值, 以P < 0.05 為差異有統計學意義, 比 值> 2.0 為顯著表達差異。對結果進行分析，篩選出冷凍後表達差異顯著的miRNAs。併使用Real-Time PCR法進行驗證。對驗證成功的miRNAs，增加20例胰腺癌樣本進行進一步驗證，以尋找冷凍後差異顯著的的miRNAs，使搨寬氬氦刀冷凍治療胰腺癌生物學機製研究領域。 最後將檢測結果和病人生存期進行相關性分析，以尋求可預測腫瘤複發和患者生存期的miRNAs。
⑶ 擬解決的關鍵科學問題
微創冷凍治療胰腺癌的療傚評估：通過檢測患者血清篩選出與胰腺癌冷凍療傚相關的腫瘤標誌物，併進行初步評價。併以此作評估胰腺癌冷凍治療傚果、預後複發和預測患者生存期的指標之一。